腫瘤的早期診斷對于患者的治療具有重要的意義，而大多數(shù)方法在特異性、可操作性及經(jīng)濟性方面均較滿足世衛(wèi)組織的要求，如針對腫瘤代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)生物標記物或循環(huán)腫瘤細胞的檢測。

外泌體是由細胞內(nèi)多泡小體與細胞質(zhì)膜融合后釋放進入細胞外環(huán)境的磷脂雙分子層包封囊泡，直徑約40-100nm，其在血清和體液中的豐度較高，且含有腫瘤源性核酸、蛋白質(zhì)和其它生物標記物，可能在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色，在腫瘤的預測及早期診斷上具有較大的臨床應用潛力。



但現(xiàn)有的外泌體分離技術，如離心、超速離心、磁珠分離以及基于親和捕獲的微流方法，非常耗時，且純度、處理量、重復性較差，還有可能導致外泌體表面修飾，不利于后續(xù)功能分析。

而使用簡單的三步連續(xù)過濾方法，包括直流預過濾、切向流過濾和低壓蝕刻膜過濾，可從細胞培養(yǎng)上清或體液中分離外泌體，保證較高的純度、確定的粒徑分布以及功能性完整，并有效去除游離的蛋白質(zhì)和其它低分子量物質(zhì)、大于100nm的細胞外囊泡以及細胞碎片。

三步連續(xù)過濾操作包括：

? 0.1μm 直流過濾

以MDA乳腺癌細胞培養(yǎng)獲得的150ml上清液先用0.1μm直流濾器過濾去除漂浮細胞、細胞碎片以及較大的剛性培養(yǎng)基成分，外泌體和較大的柔性顆粒通過膜。
 

? 500kD 切向流過濾
 

將收集的濾液轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，并在4℃條件下進行切向流過濾，使用KrosFlo 研發(fā)用 IIi 切向流過系統(tǒng)，結(jié)合500kD MidiKros mPES中空纖維過濾組件。包括游離蛋白在內(nèi)的小分子通過中空纖維膜孔進入濾液，而包括外泌體和小囊泡在內(nèi)的大分子，被截留在循環(huán)液中，并濃縮至50ml。

然后再以PBS進行5體積的恒體積洗濾，以進一步去除小分子污染物。洗濾結(jié)束后，將回流樣品濃縮至~10ml，并以10ml PBS沖洗系統(tǒng)，回收管路及過濾器內(nèi)可能殘留的外泌體，提高收率。

過濾過程中，通過壓力監(jiān)測和背壓閥調(diào)節(jié)，將跨膜壓控制在1.5-2.5psi的較低水平，以避免較小的外泌體被“擠"入濾液。

? 100nm 蝕刻膜過濾
 

收獲的回流液再用100nm蝕刻膜過濾器過濾。過濾時將跨膜壓控制在3.5psi以下，以避免柔性的非外泌體小囊泡通過進入濾液。

對于連續(xù)過濾法獲得的外泌體樣品，使用動態(tài)光散射、納米示蹤、免疫金標記透射電鏡、總蛋白、斑點雜交以及LC-MS/MS蛋白組學等方法進行檢測分析，并超速離心獲得樣品比較。

結(jié)果顯示，連續(xù)過濾可獲得高純度的外泌體，且由于分離過程中的外力較低，外泌體可保持功能性完整。而整個過程可開發(fā)成*自動化的系統(tǒng)，節(jié)省操作時間，降低人工操作可能導致的變異，并降低過濾過程的壓力波動。這種分離方式的大規(guī)模樣品處理能力，使其可作為新型、*非侵入的腫瘤篩選方法。

此外，切向流過濾也可用于去除含血清培養(yǎng)基中的外泌體，由于某些外泌體具有免疫特性，可能會增強調(diào)節(jié)T細胞功能、抑制自然殺傷細胞或者誘導T細胞凋亡，影響整體細胞培養(yǎng)產(chǎn)品的性能。zui近已有“無外泌體FBS"產(chǎn)品發(fā)布。而使用500kD 的中空纖維切向流過濾技術可有效去除細胞培養(yǎng)基中的外泌體